实验名称：高压放大器在介电泳效应的细胞分选研究中的应用

　　研究方向：生物医学

　　测试目的：

　　细胞分选在分析化学和生物医药领域有着非常重要的应用。在众多的分选方法中，微流控分选方法以其响应速度快、样品需求少等优点成为研究热门。微流控细胞分选法可分为被动分选法和主动分选法。被动分选法对待分选细胞的性质无要求，且无需预标记，对芯片结构设计及加工要求较高，且容易出现过滤结构被堵塞等问题。主动分选法分选效率高，但对待分选的细胞通常有特殊要求，且大多需要对样品进行预标记等处理，严重影响细胞活性。

　　结合被动分选法和主动分选法的优点，本文提出一种基于微结构过滤法和介电电泳效应的新型细胞分选方法。该方法在一定程度上克服了单一分选方法的弊端，有望解决微结构过滤法普遍存在的堵塞问题。具体实现方式是在微过滤结构区域集成微电极，通过调节过滤结构几何参数和加载的交流信号参数，诱导形成可以驱动细胞往低场强区域运动的负向介电电泳效应，进而避免待分选细胞在过滤孔区域的堵塞。

　　测试设备：ATA-2042高压放大器、函数信号发生器、蠕动泵、笔记本电脑、科研级摄像头、倒置荧光显微镜、单反相机等。

　　实验过程：

　　①样品溶液配制

　　使用非生物类样品和生物类样品来验证所设计多级化分选微流控装置。非生物类样品选用37μm、16.3μm和9.7μm三种尺度不同的微粒混合而成，使用PBS缓冲液调节其浓度到10⁴~10⁵/mL水平；为防止微粒之间相互黏附以及微粒和芯片之间的黏附，在缓冲液内加入0.1%v/v浓度的Tween20。实验中使用的PBS缓冲液浓度为1mM，即10%浓度的PBS缓冲液，其电导率为0.17S/m，较低的电导率可以在一定程度上减少实验过程中所产生的焦耳热效应，降低其对待分选的样品活性的影响。

　　生物类样品选择了雨生红球藻和片球藻的混合悬液。两种藻类均培养于BG11培养基。取适量雨生红球藻和片球藻混合在一起，细胞浓度调节至104~105/mL水平。需要注意的是，由于藻类密度较大，在初步的预实验中发现其极易沉底，在进样口处形成堆积，且在微流控芯片内部流动性较差，因此在每毫升混合藻细胞悬液中加入0.4g山梨醇。

　　②实验平台搭建

图：实验平台

　　在进行实验之前，要按实验需求搭建实验平台。上图所示所示为搭建好的实验平台。芯片出口通过导管与蠕动泵相连接。蠕动泵向外抽取液体，在芯片内形成负压，以此驱动待分选微粒或藻细胞的运动。信号发生器与电压放大器相连后通过导电胶布与ITO电极连通，为芯片提供所需激励信号。实验过程的现象和数据采用单反相机与倒置显微镜相结合的观测手段来获取，实现整个实验过程的实时观察和记录。

　　③芯片预处理

　　在注入实验样本之前，需要对芯片进行预处理。在微粒分选实验中，在芯片入口处加载不含微粒的10%PBS缓冲液；在藻细胞分选实验中，在芯片入口处加载不含细胞的BG11培养液。在芯片毛细作用和亲水性的共同作用下，缓冲液会快速充满整个芯片通道。打开蠕动泵，设置抽取速度为1mL/min，并抽取5分钟。该步骤的目的是完全消除芯片内的气泡，防止气泡影响微粒的运动轨迹以及避免实验中气泡可能造成的电极电解问题。

　　④滴加样品

　　使用移液器吸取50μL实验样本，加载于芯片入口处。在蠕动泵诱导的负压作用下，上述样品会在微流控芯片内向出口处流动。

　　⑤加载信号

　　开启信号发生器和电压放大器，加载交流信号于ITO电极上。调节信号频率和幅值，优化分选效率。

　　⑥实验记录

　　打开单反相机，记录实验过程。

　　实验结果：

图：37μm、16.3μm和9.7μm微粒的分选过程（A1-A4）第一级过滤级分选效果；（B1-B4）第二级过滤级分选效果

　　第一级过滤级分选情况如上图A1~A4所示，16.3μm微粒和9.7μm微粒不断的通过微柱间距为25μm的第一级，而37μm的微粒在介电电泳力的作用下，一直在过滤孔附近运动，并没有直接堵塞住过滤孔。当微粒运动到第一级过滤结构（过滤孔大小为25μm）附近时，直径37μm、16.3μm、9.7μm的三种微粒会呈现出不同的受力及运动状态：直径37μm的微粒因大于过滤柱间的过滤孔尺度，必然不能通过该过滤级。该微粒在流向过滤孔的过程中，电场梯度不断增大（两微柱间过滤孔区域为最大电场强度梯度区域），所受负向介电电泳力nDEP也随之增强，在曳力和nDEP作用下，微粒的运动速度会降低，并继续保持向过滤孔区域运动。此时，微粒所受nDEP力进一步增强，直至能够抵消细胞所受的曳力，达到受力平衡态。但微粒会继续在惯性作用下向过滤孔区域运动，此时，在进一步增强的nDEP效应下，微粒会被反向推离过滤孔区域。上述过程会反复进行，微粒会在此处呈现出振荡状态，运动往复轨迹不断减小，直至达到相对平衡状态，从而在过滤孔区域形成聚集而不堵塞过滤孔的分布态势，避免传统微结构过滤分选易出现过滤孔被微粒堵塞的情形发生。

　　第二级过滤级分选情况如上图B1~B4展示，部分9.7μm到达过滤孔附近能够立马穿过过滤孔，其余9.7μm微粒会先在过滤孔附近聚集，然后连成串一起过去。当16.3μm和9.7μm的微粒运动到第二级过滤级附近时，由于第二级过滤级的过滤柱的结构效应，其电场梯度较第一级更强，直径16.3μm的微粒形成的nDEP及曳力联合作用下，使其呈现出与直径37μm微粒在第一级过滤级相似的运动状态，在第二级过滤级的过滤孔区域呈现堆积而不堵塞过滤孔的分布。同时，因尺度效应受nDEP较小的9.7μm的微粒流通过两微柱间的过滤孔进入后续结构。

　　在不加载正弦激励信号情况下，芯片很快就会因为过滤孔被堵塞而不能工作。本文在通过集成ITO微电极，借助负向介电电泳效应较好地解决了传统微结构过滤法存在的堵塞问题，能够在很大程度上改善芯片的分选通量。

　　安泰ATA-2042高压放大器：

图：ATA-2042高压放大器指标参数

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　　本文实验案例参考自知网论文《基于微结构过滤和介电泳效应的细胞分选微流控芯片及分选方法研究》