实验名称：聚焦超声对S180肿瘤细胞膜理化性质的影响

　　研究方向：生物医疗

　　测试目的：

　　细胞膜是细胞生命活动中有着复杂功能的重要结构其基本作用在于维持细胞内外环境的相对稳定而其通透性、完整性及流动性等理化性质则与胞内外信息传递、物质能量交换等多种功能有着密切的关系‚膜的有序结构影响着生命活动的正常进行。当细胞癌变后‚癌细胞膜更新较快‚比正常细胞更易受到外界环境的影响‚因此成为近年来肿瘤细胞分子生物学研究的热门领域。有实验发现‚超声在处理细胞时‚可促使细胞膜局部破裂‚从而改变细胞质膜的通透性使胞内物质释放或使胞外物质进入细胞‚进而影响细胞执行正常的生理活动。超声的作用机制一般包括：机械作用、热效应和空化作用，有研究表明主要是超声空化作用引起的机械剪切力和热效应导致细胞膜改变，但其具体的作用机制并不清楚。因此本实验采用超声频率为2.2MHz‚筛选最佳的声照强度及处理时间以作用于S180肿瘤细胞‚通过检测细胞内FD500的阳性染色率和荧光强度、乳酸脱氢酶释放量及膜流动性的改变以研究超声对S180细胞膜的损伤作用；并初步探讨单纯聚焦超声造成这些改变的具体作用机制。

　　测试设备：ATA-8202射频功率放大器、有流式细胞仪、荧光显微镜。

　　实验过程：

　　接种S180肿瘤细胞于ICR系健康小白鼠腹腔1周左右，收集腹水细胞并稀释，重悬于0.85％生理盐水，调节细胞密度为1.0×10⁶cells／ml，同时台盼兰染色计数保证细胞存活率在99％以上。将细胞分装在医用一次性薄壁采血管中（1ml／管），并随机分为对照组（CT）和不同超声处理组（U），每组三管然后进行声超处理，实验至少重复三次以确认结果的可靠性。

　　采用频率为2.2MHz声照时间为60s，超声强度分别为0、1、2、3、4、5、6、7W／cm²；采用声照强度为3W／cm²，处理时间分别为0、15、30、45、60、90s作用于S180细胞。台盼兰拒染法检测不同处理后细胞的相对存活率，台盼兰配成0.4％的染液，声照处理后取部分细胞悬液用台盼兰染色后在光镜下用血细胞计数板计数。细胞相对存活率计算公式：存活率＝实验组拒染细胞数／对照组拒染细胞数×100％。

　　收集S180肿瘤细胞并稀释调整细胞密度为1.0×10⁶cells／ml，分装于一次性医用采血管中（1ml／管）。将各管细胞随机分为1个对照组和2个实验组（不同声照时间组），每组3管。其中对照组每管加50μl生理盐水，各实验组每管避光加入50μlFD500工作液（终浓度为10mg／ml），辐照实验完毕，即刻离心收集细胞，用PBS反复洗涤，悬浮，高速离心以除净细胞外FD500。流式细胞仪检测荧光染色阳性细胞（FD500进入细胞）每个样品检测1.0×10⁴个细胞；同时荧光显微镜观察荧光染色阳性细胞，至少观察十个视野并以CCD捕捉图像（×40）。

　　LDH释放是细胞膜损伤的敏感指标之一，实验完毕后，采用LDH试剂盒测定各组细胞膜的损伤程度，步骤严格按照试剂盒说明书进行。计算公式：LDH活性（U／L）＝（测定空白管吸光度值－空白管吸光度值）／（标准管吸光度值－标准空白管吸光度值）×标准管浓度（2μmol／ml）×样本测试前稀释倍数。LDH单位酶活性定义为每毫升细胞悬液（1.0×10⁶cells）在本反应体系中使反应液中2μmol／ml2，4-二硝基苯肼转化为丙酮酸二硝基苯腙所需的酶量。

　　荧光偏振法检测细胞膜脂流动性，配制2×10^－3mol／mlDPH母液，于用前用PBS稀释为标记膜脂的2×10^－6mol／mlDPH，37℃温育30min，PBS洗涤四次后悬于4ml0.1mol／LPBS中，在激发波长360nm，发射波长430nm处测定荧光偏振度P，计算膜脂流动性LFU＝0.5－P／P²。

实验结果：

图1：不同超声强度下各组细胞的相对存活率

　　1、超声辐照最佳强度的筛选

当超声辐照时间为60s，不同强度的聚焦超声对S180腹水瘤细胞的杀伤作用如图1所示。由图1可看出随着声照强度的增加，U组细胞相对存活率下降趋势明显，反映出细胞受损程度不断加深。超声强度为1W／cm²时，U组细胞相对存活率为95.83％，当其强度增加至2W／cm²时，细胞存活率下降幅度有所增加（89.67％），而当超声强度为3W／cm²，U组细胞相对存活率骤降至61.81％（P＜0.01）。当超声强度大于3W／cm²时，细胞相对存活率均急剧下降，但其总体趋势趋于平缓，当强度增加至7W／cm²时，存活率仅为2.38％，其损伤程度显著上升。由此可见，辐照强度3W／cm²为超声处理S180细胞的强度阈值，低于3W／cm²损伤程度过小，效果不明显，高于3W／cm²细胞受损加重，可能无法完成自身修复，而导致细胞即刻溶解。结果表明3W／cm²的聚焦超声是引发S180细胞膜损伤效应的最佳处理强度。

图2：不同处理时间各实验组细胞的存活率

　　2、不同超声处理时间对细胞存活率的影响

超声照强度为3W／cm²U组细胞存活率随声照时间延长而下降，超声处理15s时，其细胞相对存活率（91.13％）较对照组差异不显著（P＞0.05）；当超声处理时间增加到30s时，其细胞存活率降至80.65％，与对照组相比差异较明显（P＜0.05）；随着声照时间延长至60s时，细胞存活率较对照组差异极显著（61.77％）；当辐照时间进一步增至90s时，细胞损伤程度大幅度增加（43.22％）。结果表明：超声对细胞造成的损伤程度随着辐照时间的增加而升高，且30s时细胞明显受损，而60s则是超声处理S180细胞的时间阈值，因此本实验选用30s和60s作为辐照时间参数以进一步研究超声引发的膜损伤的时效关系。

图3：不同处理组S180细胞FD500阳性染色率

　　3、超声对细胞膜通透性的影响

　　大分子荧光物质FD500，通常难以进入胞膜完整的细胞。研究表明荧光右旋糖酐（FITC）不黏附在细胞膜上且FD500极少进入死细胞，因此FD500进入活细胞而使其染色可作为膜孔形成的主要标志之一。采用流式细胞仪检测FD500荧光染色阳性细胞对照组阳性细胞率仅为1.23％，而超声辐照30s与60s的阳性细胞率分别为14.17％和18.65％。同时由荧光显微镜观察各组细胞，发现：对照组几乎分辨不出荧光现象；30s与60s处理组的荧光。强度则明显增加。

　　安泰ATA-8202射频功率放大器：

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