实验名称：声化学诱导艾氏腹水瘤细胞凋亡机制初探

　　研究方向：生物医学

　　测试目的：

　　声动力学疗法(Sonody namic therapy，SDT)是利用超声(Ultrasound，Us)具有深部穿透及准确聚焦于生物组织局部的能力，激活相对无毒并且能在肿瘤细胞中特异性富集的声敏剂分子血卟啉衍生物，产生具有高氧化活性的单线态氧等自由基，能有效地杀肿瘤细胞从而治疗癌症的新方法。

　　学者主要提出超声空化效应、单线态氧理论、自由基理论等，但声动力学疗法对肿瘤细胞作用的生物学机制仍不清楚。在超声激活血卟啉杀伤癌细胞的研究中，通过扫描电镜、透射电镜以及PI-HO和Annexin V-PI荧光双染，观察受损后细胞形态结构的变化，曾发现处理后的S180和艾氏腹水肿瘤细胞(EAT)有核物质凝集、趋边排列以及凋亡小体的形成等细胞凋亡特征，提示声动力学疗法不仅能直接杀伤肿瘤细胞，还可通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗癌症。前期声动力学疗法抗癌的形态学研究发现，线粒体是较为敏感易变的细胞器之一，它不仅是细胞的能量代谢中心，氧自由基的重要产生部位，而且与脊椎动物细胞凋亡的调控密切相关。本实验采用频率为1.43MHz，声强为3.0W/cm²的高频聚焦超声和浓度为0.025mg/ml的血卟啉处理艾氏腹水肿瘤细胞，通过检测3种促凋亡蛋白的表达、超氧化物歧化酶的活性以及膜脂质过氧化物的含量，研究超声激活血卟啉诱导艾氏腹水瘤细胞的凋亡机制及其与氧自由基的关系。

　　测试设备：ATA-M110高频功率放大器模块、昆明系小白鼠、艾氏腹水肿瘤细胞系、超声探头、血卟啉衍生物为单羟乙基单乙烯基次卟啉、细胞色素c和Bax单克隆抗体、caspase-3单克隆抗体、链霉卵白素SP试剂盒。

　　实验过程：

　　接种艾氏腹水肿瘤细胞于10只小鼠腹腔1周后，随机取5只小鼠(其余5只备用)，抽取腹水细胞，分别置于医用薄壁试管(含RPMI 1640+10%小牛血清培养基)，于37℃CO₂孵箱培养。实验时用生理盐水调整细胞浓度至3×10⁶cells/ml。每只小鼠抽取的腹水细胞再分为4管，每管0.5ml细胞悬液，分别设为对照组(CT)、血卟啉组(H)、超声组(Us)和超声加血卟啉组(UH)。H组和UH组每管中加入血卟啉5μl，使其终浓度为0.025mg/ml，37℃CO₂培养箱孵育45min，Us组和UH组分别在频率为1.43MHz，强度为3.0W/cm²的超声装置中声照处理3min。各实验组分别于不同时间段取材处理。实验重复3次，以确认实验结果的稳定性。

　　免疫细胞化学检测Bax，细胞色素c，caspase-3蛋白表达各实验组分别于超声处理后0h，1h，3h取材。常规细胞涂片，丙酮固定10min，PBS洗涤3次，每次5min；含0.3%TritonX-100的PBS处理10min，以增加膜通透性，PBS洗涤3次，每次5min；0.3%H₂O₂-甲醇于37℃处理15min，封闭内源性过氧化物酶，PBS洗涤3次，每次5min；正常山羊血清于37℃封闭30min，封闭非特异性结合位点；分别滴加抗Bax、细胞色素c和caspase-3单克隆抗体(1∶100，1∶50，1∶500)，4℃孵育过夜，阴性对照组以0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)取代一抗；加入的二抗为生物素标记羊抗兔IgG或生物素标记羊抗小鼠IgG，室温孵育1h，PBS洗涤3次，每次5min；滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，室温孵育1h，PBS洗涤3次，每次5min；DAB显色，梯度酒精脱水，中性树胶封固盖片。

　　实验结果：

　　根据免疫细胞化学光镜观察结果和两因素重复测量方差分析可见，不同处理方法对Bax，细胞色素c和caspase-3蛋白有极显著影响，不同取材时间对这三种凋亡蛋白亦有极显著影响。Tukey HSB法多重比较显示：0h时各实验组之间无显著性差异(P>0.05)；处理1h时，UH组的3种促凋亡蛋白表达均高于其它3个处理组(U，H和CT组)，差异极显著(P<0.01)；3h时，U组和UH组3种蛋白表达均比CT组和H组高，差异极显著(P<0.01)，UH组的蛋白表达高于U组，差异极显著(P<0.01)。而3种促凋亡蛋白表达的时滞效应分析结果也表明：各实验组中CT和H组的3种促凋亡蛋白随时间延长表达量无显著变化；U组的蛋白表达量在处理3h时显著升高；UH组的蛋白表达量随时间延长持续升高(平均光密度值表示阳性细胞蛋白表达强度，平均光密度值越小则表达信号越强)。

　　EAT细胞中SOD活力和MDA水平测定结果，超声+血卟啉处理EAT细胞后1h取材，发现与CT和H组相比，U组的SOD活力略有降低，但不显著(P>0.05)，细胞膜脂质过氧化水平无显著变化(P>0.05)，UH组的SOD活力显著降低，细胞膜脂质过氧化水平显著升高。(P<0.01)

　　表1：Tukey HSB法对不同取材时间Bax、细胞色素c和caspase-3平均光密度值(×10^-4)的多重比较

　　图1：不同时间段取材各组Bax蛋白平均光密度值变化

　　图2：不同时间段取材各组细胞色素c蛋白平均光密度值变化

　　安泰ATA-M110高频功率放大器模块：

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